唐三作为核心主角拥有双生武魂蓝银皇和昊天锤，同时具备先天满魂力的天赋。他的成长路径贯穿整个剧情，从诺丁学院的初学到最终成为海神，技能体系涵盖控制、爆发和生存，蓝银领域与杀神领域是其核心战斗特性。小舞作为十万年魂兽柔骨兔化形，与唐三的感情线深刻影响了剧情走向，她的柔技和无敌金身技能在游戏中通常定位为高闪避刺客型角色，而献祭剧情也衍生出特殊的复活机制。
史莱克七怪中的戴沐白与朱竹清是典型的强攻系与敏攻系组合。戴沐白的白虎武魂以高爆发著称，魂技白虎烈光波、白虎金刚变强化输出，武魂融合技幽冥白虎更是团队战的核心爆发手段。朱竹清的幽冥灵猫擅长高速切入和精准打击，魂环搭配侧重暴击与攻速，两人在PVP和副本中均有稳定表现。宁荣荣作为七宝琉璃塔魂师，是游戏内顶尖辅助角色，其魂技提供治疗、属性增益和魂力恢复，而奥斯卡的食物系武魂则通过制造香肠赋予队友特殊buff，包括复活效果。
反派阵营中，比比东和千仞雪是后期关键角色。比比东的双生武魂死亡蛛皇与噬魂蛛皇赋予她极强的控场与持续伤害能力，罗刹神传承技能在游戏中通常表现为范围减益和即死效果。千仞雪的天使武魂具备神圣属性攻击，六翼天使真身能大幅提升团队生存，其剧情中的潜伏与反转也影响了阵营玩法的设计。剑斗罗尘心、骨斗罗古榕等角色作为高阶战力，在限定玩法或宗门系统中拥有特殊地位。
其他重要角色如马红俊的邪火凤凰武魂擅长范围灼烧，柳二龙的暴龙武魂主打近战压制，独孤博的碧磷蛇皇则以毒系持续伤害见长。这些角色的技能设计和原著特性高度关联，例如马红俊的凤凰流星雨需注意能量管理，独孤博的毒阵需配合地形触发最大效果。玩家在培养时应根据阵容需求选择核心输出或功能型角色，并关注魂环搭配对技能机制的改变。
武魂殿的黄金一代如邪月、胡列娜等，在特定版本中可能作为可操作角色登场。邪月的月刃武魂以多段攻击和残血收割为特色，胡列娜的妖狐武魂则侧重魅惑控制，其武魂融合技妖魅能创造领域效果。这类角色通常需要较高养成度才能发挥实力，但剧情副本中往往作为强力对手出现。
斗罗大陆的角色体系依托原著构建，每个角色的定位和技能都体现了其背景故事。玩家需结合角色特性、魂环配置和团队协作来制定策略，无论是推图、竞技还是宗门战，合理的角色搭配都是提升体验的关键。
